评估CDR除氧化和异构化对mAb目标结合的影响,使用亲和度解析的2D-SEC-SCX-MS分析

科学领域:

• 生物化学 生化学
• 分析化学 分析化学
• 生物制药开发 生物制药开发

背景情况:

• 在单克隆抗体 (mAb) 互补性确定区域 (CDRs) 中的翻译后修饰 (PTM) 可以改变标结合,这对治疗开发构成挑战.
• 目前评估PTM关键性的方法往往是低通量和复杂的.
• 微妙的PTM如阿斯巴拉金 (Asn) 脱氧化和酸 (Asp) 异构化是普遍和关键的,但很难用现有的技术来分析.

研究的目的:

• 在mAb CDR中开发一种高度选择性和敏感的方法来评估特定地点的PTM,特别是Asn脱amid化和Asp异构化.
• 克服现有的基于亲和力的方法的局限性,用于分析具有微妙质量变化的PTM.
• 为了能够对单个CDR PTM对抗体-抗原结合亲缘关系的影响进行定量评估.

主要方法:

• 开发和应用2D-LC-MS方法,将亲和度解析尺寸排除色谱 (SEC) 与在线强阴离子交换色谱 (SCX) 结合起来.
• 利用后列变性 (PCD) 辅助的完整质量测量来分析具有显著质量转移的PTM.
• 应用SCX分离,在Fab片段层面对mAbCDR修改具有高选择性,用于微妙的PTM分析.
• 通过涉及内部mAb和trastuzumab的案例研究证明了该方法的实用性,分析了特定地点的脱和异构化.

主要成果:

• 2D-LC-MS方法成功实现了特定于位点的分辨率,用于分析治疗mAbs中的Asn脱amid化和Asp异构化.
• 在trastuzumab的CDR中证明了对多个PTM的有效评估.
• 开发了一种定量方法来估计受单个CDR修改影响的抗原-抗体相互作用的解离常数 (KD) 的相对折叠变化.
• 这种新方法克服了以前用于微妙PTM的亲和度解决SEC-MS技术的局限性.

结论:

• 结合的亲和度解析SEC和在线SCX-MS (2D-LC-MS) 是一个强大的工具,用于评估与治疗 mAbs. CDR PTM相关的关键质量属性.
• 这种方法提供了对Asn脱胺和Asp异构的特定位置的见解,这对于了解它们对抗体功能的影响至关重要.
• 对约束亲和力变化的定量评估使我们能够更全面地了解mAb发展中的PTM关键性.