对一种偏爱NAD的石基酸脱酶突变体的定向进化,以提高催化效率
Xiaobei Liu1, Weiwei Su1, Lingyun Zhang2
1Henan Engineering Research Center of Bioconversion Technology of Functional Microbes, College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang, 453007, China.
代谢工程面临着辅助因子失衡,特别是与依赖NADPH的酶,如shikimate dehydrogenase (SDH). 这项研究设计了具有增强NAD利用力的新型SDH突变,克服了以前的效率限制,以改善生物生产.
科学领域:
- 代谢工程是代谢工程.
- 生物催化剂是一种生物催化剂.
- 酶工程是什么? 酶工程是什么?
背景情况:
- 辅因子失衡是代谢工程中的一个主要障碍,特别是当微生物宿主与NADH主导的氧化还原池表达需要NADPH的途径时.
- 在shikimate通路中的NADPH依赖的shikimate脱酶 (SDH) 是一个瓶,合理的设计努力产生了严重损害效率的突变物.
研究的目的:
- 为了解决辅因子失衡问题,通过改进新型的石基酸脱酶 (SDH) 突变来改善NAD利用.
- 为了克服之前设计的偏爱NADH的SDH突变体的催化效率低下.
主要方法:
- 实施了以结构为导向的和突变发生策略,针对SDH的辅因子结合口袋.
- 结合突变发生与高通量选用于NAD利用.
- 在shikimate-auxotrophic大肠杆菌菌株中使用体外试验和体内补充的突变性表现的特征.
主要成果:
- 开发了新的SDH突变,显著提高了NAD相关的催化效率,并保持了热稳定性.
- 鉴定了一种最佳突变,SDHNAD-S193H,由于减少了NAD的Km,NAD依赖效率 (kcat/Km) 提高了25倍.
- 证明了强大的体外活性和成功的体内补充工程SDH突变的成功.
结论:
- 改造的SDH突变提供了一个有效的酶模块,用于shikimate生物生产.
- 这项工作为重新编程NADP依赖酶中的辅因子偏好提供了机理性的见解.
- 结构导向的方法是有效的工程辅因子在酶的特异性.
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