快速和简单的检测Mycobacterium avium亚种. 使用基于CRISPR-Cas12a结合复合酶聚合酶放大或嵌套PCR的侧向流量试验

科学领域:

• 兽医诊断 兽医诊断 兽医诊断 兽医诊断
• 分子生物学分子生物学
• 微生物的病原发生.

背景情况:

• 结核病 (PTB),是由Mycobacterium avium亚种引起的. 甲状腺结核病 (MAP) 在反动物养殖中是一个巨大的经济负担.
• 目前对PTB的诊断方法缺乏所需的敏感性和特异性,阻碍了有效的控制和根除工作.
• 迫切需要先进的检测技术来准确识别牲畜中MAP感染.

研究的目的:

• 开发和验证用于Mycobacterium avium亚种的新型诊断试验. 结核病 (MAP) 的检测.
• 将复合酶聚合酶放大 (RPA) 和嵌套PCR与CRISPR-Cas12a技术集成,以提高灵敏度和特异性.
• 提供灵活的检测平台,可适应各种资源设置,用于实际的PTB管理.

主要方法:

• 针对RPA和嵌套PCR的MAP ATPase FtsK基因的crRNA和原始基因的设计.
• 使用RPA或嵌套PCR放大便DNA,然后进行净化.
• 使用CRISPR-Cas12a检测放大DNA,通过qPCR仪器,光读取器或横流带读取信号.
• 在临床样本和MAP培养上优化和验证RPA-CRISPR-Cas12a和嵌套PCR-CRISPR-Cas12a试验.

主要成果:

• RPA-CRISPR-Cas12a试验的检测极限为1×10−10μg/μL,而嵌套PCR-CRISPR-Cas12a试验的检测极限为1×10−14μg/μL.
• 在DNA度≥1×10−4μg/μL时观察到有效的ssDNA记者裂变,产生强烈的光信号.
• 所有开发的测定方法在测试样本中与参考方法完全一致,证实了高精度和特异性.

结论:

• 这项研究报告了RPA或嵌套PCR与CRISPR-Cas12a用于MAP检测的首次成功集成.
• 开发的分析提供了PTB的快速,高度敏感和特定的诊断能力.
• 灵活的检测选项有助于在各种环境中实现实际应用,从而改善了准结核病控制计划.