在Burkholderia cenocepacia中对purM的功能分析,使用三甲胺可选择的等位基交换和迷你Tn7补充方法

科学领域:

• 微生物学和分子遗传学
• 细菌病原体的产生
• 基因工程是一种基因工程.

背景情况:

• 伯克霍尔德菌 (Burkholderia cenocepacia,简称Bcc) 对免疫受损的个体,特别是患有囊性纤维化的人来说是一个重大威胁.
• 了解B. cenocepacia的发病因子受制于有限的基因操纵工具.
• 纯M基因对蛋白生物合成,细胞内生存和相关物种如Burkholderia pseudomallei的毒性至关重要.

研究的目的:

• 适应和验证B. cenocepacia中无标记基因删除和特定位点染色体补充的遗传工具.
• 在B. cenocepacia中功能性地表征必需的purM基因.
• 扩大用于研究这种临床相关的机会性病原体的分子工具包.

主要方法:

• 适应非复制性pEDL1005载体用于无标记的purM基因删除,使用基于sacB的对选择,与特定菌株的糖度.
• 采用基于迷你Tn7的系统 (pUC18T-迷你Tn7T-TMP) 来进行purM基因的特定位点染色体补充.
• 开发一种基于PCR的方法,以验证glmS同类物下游的精确转体子插入.

主要成果:

• 在参考 (K56-2) 和临床 (SCBC075) B. cenocepacia菌株中成功删除了purM基因.
• ΔpurM 突变体表现出严格的腺辅,证实了 purM 在 de novo purin 生物合成中的重要作用.
• 与B. pseudomallei不同的是,ΔpurM突变体在巨细胞内细胞内存活率没有显著减弱.

结论:

• 在B. cenocepacia中,pEDL1005载体和迷你Tn7系统是无标记基因删除和染色体补充的有效工具.
• 这些经过验证的遗传工具为未来的功能研究,新陈代谢和B. cenocepacia的病变研究提供了一个强大的平台.
• 这项研究扩大了这种具有挑战性的机会性病原体的分子工具包.